流式细胞仪分析

当细胞悬浮液通过流体细胞仪时，鞘液通过流体动力学聚焦细胞，使其以单行形式通过小喷嘴。由此产生的微笑流体流每次将细胞带过激光，如图1所示

图1。流动细胞仪表概述了流动细胞仪表。鞘液聚焦于细胞悬浮液，使细胞一次通过激光束。检测前、侧散射光和染色细胞的荧光。

多色流细胞仪

图2.基本多色流式细胞技术概述

当样品被引入多色流体细胞仪流动室时，它进入流体系统，并在称为流体动力学聚焦的过程中分离成单个细胞。流体动力聚焦使用受控的流体流动将样品聚焦成狭窄的直径，导致细胞分离并排列成单列。

当每个细胞通过激光时，将其记录为一个事件。对于每个事件，然后记录前散射和侧散射。如果细胞被荧光标记，激光会刺激荧光团，发射的光被收集为荧光强度。

对于检测荧光团发射特定波长的仪器，发射的光通过一系列镜子和滤光片到达合适的探测器。探测器称为光电倍增管（PMT），只检测特定波长的荧光。

滤波器阻止某些波长，并允许其他波长通过。当放置在一定角度时，两个颜色滤波器作为镜子，允许特定波长通过，而其他波长则反射。两个颜色滤波器的类型和顺序允许同时检测多个信号。

测量前向和侧向散射光

所有穿过光束的细胞活颗粒都会散射激光，由光束前的探测器测量（FS），从检测器到光束侧测量的侧向散射（SS）（图3）。

图3。当绿色激光照射到细胞时，散射。细胞散射光的方向与细胞的大小和强度有关。

FS与细胞大小有关，SS与细胞粒度成正比。因此，细胞群通常可以根据其大小和粒度的差异来区分(图4)。

a）流式细胞术测量激光的前向散射（FS）和侧向散射（SS），反映细胞的大小和粒度。b）根据FS和SS数据，如何区分不同类型的免疫细胞。

在流式细胞仪上运行血液样本是一个有用的例子。

粒细胞较大，颗粒较多，被认为是SS和FS较高的大量细胞

单核细胞是大细胞，但颗粒较小，因此它们会产生高FS但低SS的单独群体。

小淋巴细胞和淋巴母细胞形成独立的群体，FS较低，SS较低，因为它们不是颗粒细胞

因此，这些细胞只能根据FS和SS分为不同的群体(图5)。

图5。流动细胞图：FS和SS的点图。每个点代表流动细胞仪分析的单个细胞。细胞大小和粒度的差异决定了不同细胞群的特征位置。

散射光和荧光的测量

流式细胞仪中的荧光探测器除了测量样品中所有细胞或颗粒的前向和侧向散射光外，还测量阳性染色细胞或颗粒产生的荧光。例如，它们可以用特定蛋白质的荧光标记抗体或结合特定结构（如DNA）的荧光配体进行染色。这些荧光团（或荧光染料）在被具有相应刺激波长的激光刺激时会发光。

染色细胞的FS、SS光和荧光分为规定的波长，并通过流式细胞仪中的一组滤光片和镜子引导光电倍增管（PMT）传感器。PMT将光子的能量转换为电信号(电压)。荧光被过滤，使每个传感器只能检测到特定波长的荧光。

异硫氰酸荧光素在图6所示的示例中（FITC）通道PMT将检测FITC发出的波长约为519nm的光。藻红蛋白（PE）通道PMT将检测PE发出的575nm波长的光。每个PMT还将检测样品中的任何其他物质，其发射的光波长与检测到的荧光团相似。

图6. 用荧光抗体染色的细胞通过激光。

使用各种滤光片将正确波长的光子引导到每个PMT(图7).短通（SP）长通允许滤光片传输低于指定波长的光子（LP）滤光片允许传输高于指定波长的光子。

二向色滤光片/反射镜(如二向色LP反射镜)和光束成45°防止角并重定向，而不是完全阻挡不必要的波长光。例如，高于特定波长的光子直接在长通二向色滤光片中向前传输，低于特定波长的光子为90°角反射。

图7.流式细胞仪中的带通（BP）、短通（SP）和二向色滤光片。

参考文献

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